數(shù)字核酸擴增和檢測方法可提供出色的靈敏度和特異性，并可以對目標(biāo)核酸進行絕對定量。在這些方法中，數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）通常用于DNA擴增和絕對定量，其也是眾多數(shù)字化分析檢測方法的起源。dPCR由于其反應(yīng)時間長且需要精細(xì)的溫度控制，因此對于POC應(yīng)用并不理想。等溫擴增（如LAMP）提供了一種快速，低成本的選擇，利用同樣的數(shù)字化思路，dLAMP的出現(xiàn)和發(fā)展逐漸得到人們的關(guān)注。本推送主要介紹dLAMP的主要技術(shù)原理。

1.什么是LAMP及其技術(shù)原理

之前的推送一直沒有好好解讀LAMP的技術(shù)原理。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）是用于DNA擴增的單管技術(shù)，與PCR相比，等溫擴增是在恒定溫度下進行的，不需要熱循環(huán)儀，因此可大大減少儀器的復(fù)雜度，更便于開發(fā)POCT儀器。該技術(shù)最早報道于2000年日本學(xué)者Notomi發(fā)表在Nucleic Acids Research的文章。一經(jīng)發(fā)布，就受到了世衛(wèi)組織WHO、各國學(xué)者和相關(guān)政府部門的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中。截止到目前為止，文章被引超過5500次。

從原理上講，LAMP使用兩套或三套引物和一種具有復(fù)制活性以及高鏈置換活性的聚合酶，可在60–65°C的恒定溫度下擴增靶序列。通常，使用4種不同的引物來鑒定靶基因上的6個不同區(qū)域，從而大大提高了特異性。另外一對“環(huán)引物”可以進一步加速反應(yīng)。由于這些引物作用的特殊性質(zhì)，在LAMP中產(chǎn)生的DNA量明顯高于基于PCR的擴增。另一方面，引物的增加也使得LAMP引物設(shè)計變得更加困難，常常需要依賴第三方軟件和報道文獻進行輔助設(shè)計。

LAMP的擴增產(chǎn)物可以通過光度法進行檢測，LAMP反應(yīng)溶液中作為擴增副產(chǎn)物的焦磷酸鎂沉淀可以通過肉眼輕松觀察，特別是對于較大的反應(yīng)量，因此可用此開發(fā)肉眼讀出的POC傳感器。同時，LAMP也可通過測量濁度或通過使用嵌入染料（例如SYTO 9）進行熒光實時跟蹤反應(yīng)。SYBR green等染料可以用于創(chuàng)建可見的顏色變化，而無需使用昂貴的設(shè)備即可用肉眼看到該顏色變化，或者可以通過儀器更準(zhǔn)確地測量出響應(yīng)。

LAMP的反應(yīng)體系一般包括4條引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、甜菜堿、Mg₂SO₄等。LAMP檢測體系中基因的擴增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在30~60 min擴增10⁹~10¹⁰倍，特異性較高；同時反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂。LAMP技術(shù)的主要原理是DNA在65 ℃左右可以處于動態(tài)平衡狀態(tài)，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)。

2.什么是Digital LAMP

和Digital PCR類似，最早報道Digital LAMP也是利用物理腔室進行反應(yīng)分隔，只不過Digital LAMP直接使用了當(dāng)時成熟的微流控芯片。文章的作者有加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Luke P. Lee教授和Daniel T. Chiu教授，其都是該領(lǐng)域的絕對大咖。

數(shù)字化的本質(zhì)是對LAMP反應(yīng)體系的分割化，使得每個微小的反應(yīng)腔室的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。經(jīng)過擴增之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號，通過計算熒光信號的比例和泊松公式計算出核酸分子的絕對數(shù)量。

文章另一個特點是使用一種叫做自數(shù)字化的微流控技術(shù)（self-digitization chip），這種技術(shù)常見于細(xì)胞捕獲（如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲和分析）和化學(xué)合成中。根據(jù)文章報道，Digital LAMP能夠在70分鐘內(nèi)完成整個檢測，最低可檢測20個拷貝的噬菌體DNA。

        之后的研究報道更多采用液滴微流控技術(shù)進行Digital LAMP，檢測靈敏度也達(dá)到了幾個拷貝。于此同時，Digital LAMP在細(xì)菌、病毒檢測上也逐步展開，甚至逐步拓展到其它體外診斷領(lǐng)域。其中最為出名的是Rustem F. Ismagilov教授發(fā)到Science Translational medicine上的一篇文章，其使用Digital LAMP在30分鐘內(nèi)完成了常規(guī)方法需要幾天的抗體敏感性實驗AST。

3.數(shù)字化核酸擴增的特點和平臺

準(zhǔn)確度高

通過樣本的離散化，極微量的變異分子與正常分子被區(qū)分開來，使得稀有突變基因被單獨檢測，再通過陽性信號單元所占的數(shù)量和比例來精準(zhǔn)地計算突變率或突變量。

靈敏度高

具有對低拷貝核酸分子數(shù)的區(qū)分能力，這是LAMP難以達(dá)到的。

絕對定量

以陽性信號和陰性信號微單元的數(shù)量及比例來確定原始樣本中目標(biāo)核酸分子數(shù)，不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進行精確定量。

不易受抑制劑的影響

通過分散到各個反應(yīng)微單元，能夠有效降低了抑制劑對擴增的影響。

如今，商業(yè)化的dPCR平臺不斷面世，主要有Fluidigm公司的Bio-MarkTM高通量基因分析系統(tǒng)、Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統(tǒng)、ThermoFisher公司的QuantStudioTM3DdPCR系統(tǒng)、RainDanceTechnologies公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)和Formulataix公司的ConstellationTMdPCR系統(tǒng)等。為了對比Digital LAMP與其它方法在檢測性能上的區(qū)別，研究者通過使用Bio-rad公司的微滴式dPCR系統(tǒng)和Fluidigm的Biomark 12.765 Digital Array平臺檢測人巨細(xì)胞病毒，結(jié)果顯示dLAMP具有更好的抑制劑抵抗力。

4.總結(jié)

數(shù)字化核酸擴增技術(shù)是一種高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高辨識力、高耐受性、可實現(xiàn)絕對定量分析的核酸分子診斷技術(shù)，是現(xiàn)有核酸診斷技術(shù)的補充，其所具備的應(yīng)用優(yōu)勢必將大大推動生物學(xué)研究、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的發(fā)展。同時，它也預(yù)示著一個擁有巨大潛能的新興產(chǎn)業(yè)和技術(shù)。dLAMP相對于dPCR速度更快，成本也更低，在dPCR難以實現(xiàn)POCT的情況下，不失為一個新的選擇。目前的數(shù)字化核酸擴增技術(shù)仍處于待完善階段，還存在許多不足之處。比較經(jīng)典的Bio-rad液滴式dPCR系統(tǒng)由液滴發(fā)生器、PCR擴增儀和液滴信號讀取器3種設(shè)備配套組成，集成度差，儀器成本高，一般的實驗室難以承受。數(shù)字化核酸擴增技術(shù)的通量增高或者微單元體積縮小時，現(xiàn)有信號采集的方法難以做到簡便、快捷、準(zhǔn)確，常需要后期繁瑣的信號處理與分析過程。但是，隨機技術(shù)的不斷進步，相信這些技術(shù)會逐步出現(xiàn)在體外診斷的各種產(chǎn)品中。

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